Análisis de la Expresión Genética por PCR
La salud y la seguridad humanas dependen de mediciones confiables y rápidas en el diagnóstico médico y de pruebas que respalden la selección y evaluación de la intervención terapéutica [Hu, 2019; Sanders et al., 2018]. El diagnóstico preciso de patologías que afectan a los humanos puede conducir al tratamiento exitoso de diversas afecciones, y lo que es más importante a su prevención a través de programas de modelado e intervención [Gow et al., 2022; Paniz et al., 2023; Piek et al., 2023].
En la actualidad, los métodos basados en técnicas de biología molecular han demostrado ser herramientas esenciales para el diagnóstico rápido y confiable de diversas patologías [Moore, 2023]. Adicionalmente, las pruebas moleculares se están empleado con mayor frecuencia para la evaluación de la calidad microbiana de productos de uso y consumo que imponen amenazas críticas para la salud de los humanos y el medio ambiente [Boukharouba et al., 2022; Garrido et al., 2019; Mangal et al., 2016; Paruch, 2022; Rao y Arora, 2020; Tiwari et al., 2022; Zhang et al., 2022].
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el método molecular más sensible disponible en la actualidad, ya que tiene el potencial de detectar moléculas individuales; generando miles de millones de copias de la misma molécula de interés en un corto tiempo [Artika et al., 2022; Green and Sambrook, 2019; Green and Sambrook, 2018]. La PCR en sí es un proceso molecular que se utiliza para sintetizar enzimáticamente copias en múltiples cantidades de una región del ácido desoxirribonucleico (ADN) seleccionada para varios propósitos [Artika et al., 2022].
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el perfil de expresión genética de los marcadores moleculares en líneas celulares de cáncer y de inflamación en células humanas.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Realizar la separación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de una muestra de sangre y seguir el protocolo para su estimulación inflamatoria.
2. Realizar el cultivo de una línea celular de cáncer humano y su tratamiento con agentes que induzcan el proceso de apoptosis.
3. Adquirir la habilidad en el procedimiento de extracción del ARN a partir de los cultivos de PBMC y de las líneas celulares cultivadas.
4. Cuantificar el ARN extraído.
5. Realizar el proceso de transcripción inversa partiendo del ARNm obtenido.
6. Reconocer los componentes de la master mix o mezcla de reacción.
7. Agregar los componentes necesarios a la mezcla de reacción para la realización de la PCR simple.
8. Reconocer las etapas de la realización de la PCR y acondicionar el equipo correspondiente.
9. Preparar el gel de agarosa y los buffers para realizar la corrida electroforética. Preparación y colocación de las muestras en el gel.
10. Realizar la electroforesis en el gel de agarosa.
11. Visualizar y discutir los resultados obtenidos.
A estudiantes, auxiliares de laboratorio, técnicos y profesionales de las ciencias de la salud, ciencias biológicas, biotecnología, ingenieros, químicos y otras personas que deseen adquirir y mejorar sus conocimientos y habilidades prácticas en biología molecular.
Para evaluar la expresión de genes inducibles en PBMC y células de cáncer humano cada estudiante llevará a cabo el trabajo de laboratorio con 2 muestras.
Específicamente cada estudiante realizará:
- 1. Separación de PBMC humanas a partir de una muestra de sangre periférica utilizando un gradiente de densidad con Ficoll-Paque o Lymphopure™ (BioLegend).
- 2. Inducción de la expresión de genes pro-inflamatorios por medio de la estimulación de los monocitos con LPS de E. coli.
- 3. Cultivo de células de cáncer humano (adherentes o en suspensión) y su posterior tratamiento con fármacos que inducen el proceso de apoptosis en estas líneas celulares.
- 4. Extracción del ARN de las PBMC y células de cáncer (tratadas y controles). El procedimiento lo realizarán con columnas de extracción de ARN.
- 5. Cuantificación del ARN extraído mediante espectrofotometría UV, para determinar la calidad de los nucleótidos obtenidos.
- 6. Obtención del ADN complementario (ADNc) utilizando transcriptasa reversa.
- 7. Preparación del buffer para la corrida electroforética de la muestra. Preparación del buffer de carga de la muestra y preparación del gel de agarosa.
- 8. Preparación de la mezcla de reacción para la PCR (esto incluye añadir a la master mix los cebadores específicos, la muestra y el agua).
- 9. Realización de la PCR simple.
- 10. Realización de la electroforesis en gel de agarosa: Preparación del gel y de los buffers para realizar la corrida electroforética, montaje del sistema, preparación y siembra de la muestra, establecimiento de las condiciones de corrida (voltaje, amperaje y tiempo).
- 11. Visualización y discusión de los resultados obtenidos.
Al finalizar el curso el participante estará en capacidad de: 1.- Separar las células mononucleares a partir de una muestra de sangre periférica; 2.- Cultivar las PBMC y las células de cáncer humano; 3.- Realizar la estimulación del proceso inflamatorio y la activación de la apoptosis; 4.- Aislar el ARNm de las células; 5.- Cuantificar la cantidad de este ácido ribonucleico; 6.- Preparar los buffers, otra soluciones y reactivos requeridos para la RT-PCR; 7.- Preparar las mezclas de reacción para una RT-PCR y realizar el proceso de amplificación; 8.- Realizar la electroforesis y la visualización e interpretación de los resultados obtenidos.
Coordinador: Dra. Gricelis Martínez.
Coordinador Académico: M.Sc. Carmen Duque.
Coordinador Administrativo: Dr. Michael Mijares.
Dr. Michael Mijares
Farmacéutico con Mención en Análisis de Medicamentos, Doctor en Ciencias, Mención Farmacología. Investigador de las áreas de: Inmunofarmacología de la inflamación y el cáncer, evaluación de biotecnológica de cosméticos y cosmecéuticos, métodos alternativos para la evaluación de endotoxinas bacterianas y pirógenos, producción de anticuerpos recombinantes. Coordinador de Postgrado de la Facultad de Farmacia de la UCV. Jefe de la Unidad de Biotecnología, Facultad de Farmacia, UCV. Investigador Asociado del Instituto de Inmunología Dr. “Nicolas Bianco C.” Miembro titular de la Sociedad Venezolana de Microbiología.
Dra. Gricelis Martínez
Farmacéutico, con Mención en Control de la Calidad de los Medicamentos, Doctora en Ciencias, Mención Farmacología. Investigadora de la Unidad de Biotecnología de la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela. Profesora de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de la UCV. Miembro titular de la Sociedad Venezolana de Microbiología.
Licenciada. Idamelis Rodríguez
Licenciada en Biología con Mención en Biología Celular graduada de la Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, UCV. Estudios de cuarto nivel en Inmunología Básica, Instituto de Inmunología de la Facultad de Medicina de la UCV. Investigadora de la Unidad de Biotecnología de la Facultad de Farmacia de la UCV con Docencia en la Asignatura Microbiología II de la Mención de Microbiología Aplicada. Profesional y académicamente se ha desarrolla en el área de Biología Molecular, donde ha trabajado en diferentes proyectos aplicando diversas variantes de la PCR: PCR punto final, RT-PCR, NESTED-PCR, PCR-RFLP, VNTR-PCR, ARMS-PCR, qPCR, ente otras.
El costo del curso será de trescientos dólares americanos (300$) para profesionales y de doscientos dólares americanos (200$) para estudiantes; o su equivalente en bolívares a la tasa del Banco Central de Venezuela (BCV).